Låt cellerna uppvisar starkt grönt ljus--jordbaserad god Jordbrukarsed Transfection (1 / 3 steg)

Steg 1: förfarande:

Procedure:
1. utsäde cellerna:
Skörda MDCK-G cellerna från kolven. Här jag hoppa över det skörd förfarandet eftersom det är en ganska standard förfarande i varje biologi lab. Kärna ur cellen i Millicell 24-bra cell kultur infogar (Millipore PIRP12L04). För MDCK-G cell ställde jag 75K celler/200uL i varje infoga och 900ul av odlingsmedium i varje botten mataren bra. Detta sätt har 1um PET porösa membran (som innebär att det finns massor av små hål på membranet). Celler kan få näring från båda sidor.
2. transfection:
24 timmar efter sådd, MDCK-G cellerna kommer att täcka hela membran och bildar en mono-skikt.
Späd gWiz-god Jordbrukarsed med OPTI-MEM (Gibco 31985-070). God Jordbrukarsed koncentrationen jag använder är 20ug/mL. Ta bort odlingssubstratet ur skäret och lägga till 150uL för utspädda god Jordbrukarsed inuti insatsen. IPorator kan transfect fyra 24 brunnar skär (eller två 6-väl insrts) på en gång. Så jag laga fyra skär med god Jordbrukarsed.
iPorator kräver särskilda elektroder under transfection (Primax Bioscience, E24A1108). Fyll botten elektrod kammare med 1mL av Opti-MEM. Överföra vändskär med god Jordbrukarsed i botten elektrod kammare och sätta i den översta elektroden.
Nästa steg, sätta elektroden uppsättningen med skär in i iPorator.
Klicka på "Transfection" i användargränssnittet.
Programmet har en inbyggd MDCK-G DNA transfection protokoll, så jag väljer protokollet och klicka på "Start". Det tar ca 4 minuter till slut transfection.
Efter transfection, ta elektroden ställa ur maskinen och överföring skär tillbaka till den ursprungliga feeder plattan. Lämna skären i rumstemperatur i ca 10 minuter med god Jordbrukarsed och sedan ersätta den god Jordbrukarsed med 200ul färskt odlingssubstrat. Sätta skär tillbaka till cellen kultur inkubator för 24 timmar att låta god Jordbrukarsed express. För gWiz-god Jordbrukarsed, kan du se några uttryck 2 timmar efter transfection, men du måste vänta minst över natten för att fullt ut uttrycka.