Ghost hjärtat i en burk! (2 / 9 steg)
Steg 2: Protokollet
Detta papper har en god överblick över de olika metoder som används för vävnad decellularization:
En översikt av vävnad och hela organ decellularization processer
Vi har faktiskt två olika varianter av gris hjärtat protokollet: som ursprungligen Publicerad av Wainwright et al i deras 2010 papperoch modifierade protokollet från den 2012 video i journalen om visualiseras experiment, av samma grupp. Båda versionerna börja med frysning på-80C och sedan upptining hjärtat, för att hjälpa till att bryta upp celler.
Wainwright et al papper:
- BEGJUTA 3L typ 1 reagens klass vatten i 15 min på 1 L/min, sedan 2xPBS (fosfatbuffrad saltlösning) i 15 min på 1 L/min
- BEGJUTA 0.02% trypsin / 0,05% etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt / 0,05% NaN3 vid 37C för 2h på 1 L/min
- BEGJUTA typ 1 vatten i 5min, sedan 2xPBS för 15min
- BEGJUTA 3% Triton X-100 / 0,05% etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt / 0,05% NaN3 för 2 h på 1,3 L/min
- BEGJUTA typ 1 vatten i 5min, sedan 2xPBS för 15min
- BEGJUTA 4% deoxycholic lösning för 2h på 1,3 L/min
- BEGJUTA typ 1 vatten i 5min, sedan 2xPBS för 15min
- BEGJUTA 0,1% perättiksyra / 4% etanol för 1h på 1,7 L/min
- BEGJUTA med PBS två gånger, och typ 1 vatten tre gånger, 15min vid 1,7 L/min
Om du lägger till allt tillsammans, tar detta protokoll ca 10 timmar från start till slut för alla perfusion steg. Den modifierade versionen från Jove video går igenom mycket samma steg, förlängning av trypsin och deoxycholic behandling-3h och rengöringsmedel behandling till 2.5 h, för en sammanlagd tid av cirka 13 timmar perfusion! De ramp också perfusion hastigheten från 400ml/min för den inledande vatten perfusion, 2,2 L/min för deoxycholic och efterföljande steg.
I vårt fall, vi hade bara ca 10 timmar totalt åstadkomma detta, och vi sår upp spendera en bra summa då testa pumpen, fastställande läckor i anslutningar, dissekera ner hjärtat etc. Så sår vi upp justera varaktigheterna att passa in i den tid som återstår.
Å andra sidan, eftersom vi gjorde ett mönsterexempel snarare än ett spöke hjärta som kunde vara framgångsrikt reseeded med stamceller, visste vi att vi kunde enkelt fuska på några av ingredienserna. I synnerhet använde vi vanligt kranvatten i stället för gallon och gallons dyra "Typ 1" reagens klass vatten. På samma sätt använde vi bara vanligt kök salt i kranvatten i stället för fosfatbuffrad saltlösning. Vi använde OxyClean (natrium percarbonate) istället för perättiksyra och 151-bevis Everclear istället för reagens grade etanol för det slutliga desinfektion steget. Vi ville också använda SDS snarare än Triton X-100 som tvättmedel, sedan SDS tenderar att bleka vävnaden bättre (på bekostnad av att somewha hårdare på den extracellular matrisen). Vi hade inte riktigt tillräckligt SDS, så vi avvecklas kommer med 2% SDS / 1% Triton X-100. Vi lämnade även ut den natriumazid (NaN3), som är där för att hämma bakterietillväxt, men är också mycket giftigt - något vi inte vill snarare bråka med i en DIY miljö.
Åh, och vi hade inte tillgång till en hög volym peristaltiska pumpen, men vi hade en Bio-Rad buffert återcirkulation Pump (se http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702929C.pdf) som klarar teoretiskt upp till 1,5 L/min. Inte avsedd att förse typ av påtryckningar som vi behöver, men meh - låt oss bara se vad som händer...
Så är här vad vi sår upp med i slutet:
- BEGJUTA 3L kranvatten för 15min, sedan hög saltlösning (50g kök salt i 3L kranvatten) för 15min
- BEGJUTA 0.02% trypsin / 0,05% etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt på 37C för 1,5 h
- BEGJUTA kranvatten i 10min, då hög koksaltlösning i 10min
- BEGJUTA 2% SDS / 1% Triton X-100 för 50 min
- BEGJUTA kranvatten för 5min, då hög saltlösning för 5min
- BEGJUTA 2,5% desoxicholsyra (25g i 1L) för 20min
- BEGJUTA kranvatten för 5min, då hög saltlösning för 5min
- BEGJUTA 0,5% OxyClean / 4% etanol för 1h på 1,7 L/min
- BEGJUTA saltlösning (25g 3L), då vatten i 5min
- Låt rinna, då saker till Ikea burk med 151 bevis Everclear!