Utforska din arvsmassa! (16 / 18 steg)

Steg 16: Avancerad DIYBio genetisk analys: PCR och Gel analys

Metoden polymeraskedjereaktion (PCR) är en av de mest kraftfulla verktygen i den genetiker verktygslåda. PCR är en enzymatisk metod av logaritmiskt komplettera upp riktade regioner av DNA för vidare analys med hjälp av en serie av värme och kyla steg. Långt borta är dagarna av praktikanter doppning injektionsflaskor av prover i vattenbad, numera vi använder automatiserade termisk cyclers med en Peltier-elementet för att cykla temperaturer och några medborgare forskarna har även tagit fram DIY versioner för oss DIY-biologer att använda.

Den enklaste DIY termocykel jag har sett är Gen maskin postat på populärvetenskap. Man använder en glödlampa, en typ av Easy-baka-ugn inställning till en standard termocykel. En annan DIY termocykel använder motstånd i detta instructable för Arduino PCR. Ännu använder en annan ett liknande tillvägagångssätt med ett värmeelement i kaffe kopp termocyklern.

En gel elektrofores maskin kan vara lättare för DIY biologen till göra och springa. Mönster varierar i komplexitet från relativt nybörjare (större betoning på den relativt) setup postat på gör att de mer avancerade instructables för GellS eller mini gel system. För att köra en gel, skulle jag råda metoden beskrivs i den ovannämnda gör posten men mer avancerade användare kan följa den instructable för gel förberedelse eller självklart följa protokollet på Öppna våta Ware. Naturligtvis måste du antingen köpa eller göra en pipett till utföra de likvida överföringarna och gör en transilluminator (som detta eller detta) att se dem i.

Naturligtvis, om du vill utföra PCR behöver du utforma primers att förstärka din sekvens av intresse. Primer är helt enkelt korta enkelsträngade DNA-sekvenser som är gratis till områden flankerande din sekvens av intresse. De är nödvändiga för DNA-sekvensering samt den mer DIY-Bio-vänlig sekvens specifika PCR (SSP) som sedan kan differentieras på en gel. Det finns flera företag att beställa primers från, genom att söka på internet efter "primer syntes företag" du kanske kan hitta en som kommer att leverera till individer eller DIY labs. För sekvensering eller SSP är det viktigt för att utföra en inledande PCR för att komplettera och berika din mål region, inkluderar några tips för en lyckad PCR:

• Target PCR längder bör runt 500bp men sällan bör överstiga 1000bp
• Tar ca 30 sekunder av förstärkning per 500bp
• Hålla framåt och bakåt primer smältande temperaturer inom ±1 ° C om möjligt
• Undvika inriktning regioner med återkommande nukleotider (poly-skrifter, dvs. AAAAA... eller GCGCGCGC...)
• Undvik att placera din primers i regioner med gemensamma SNP

Du kan se på bilden att detta steg jag använder Primer3 för att hitta primers att rikta beta-thalassemi SNP för sekvensering. Använda program som Primer3 för primer design är en bra idé eftersom de ger dig primer kombinationer med bästa termodynamiken (se här för primer egenskaper). Sedan ska du kontrollera din primers i omvänd e-PCR (se andra bilden) för att se till att de är specifika för endast din mål sekvens. För mer information om hur du skapar en bra PCR-reaktion klicka här.